Originaire de Belgique, Jonathan Zaccaï pense d'abord à une carrière de réalisateur avant de se tourner vers le métier d'acteur. Après un passage par la publicité - il figure dans de nombreux spots diffusés pour certains en Angleterre - et quelques apparitions au cinéma (La Révolte des enfants, 1991) et à la télévision (Lifeline, 1996), il campe le petit ami insatisfait de Corinne Debonnière dans Petite chérie (2000) d'Anne Villaceque.
Sa carrière lancée, il balade son physique de jeune premier dans Les Déclassés (2001) et Reines d'un jour , et s'illustre dans quelques premiers longs métrages comme Bord de mer (2002) de Julie Lopes-Curval et Le Tango des Rashevski (2003) de Sam Garbarski. Fidèle à ces deux cinéastes, il retrouvera la première pour Toi et moi (2005), comédie romantique où il aura pour partenaires féminines Marion Cotillard et Julie Depardieu, et le second pour Quartier lointain en 2009.
Le grand public découvre véritablement Jonathan Zaccaï aux côtés d'Agnès Jaoui et Karin Viard dans Le Rôle de sa vie (2004), tandis que la critique salue sa prestation de mort-vivant au regard pénétrant dans Les Revenants de Robin Campillo. Valeur montante du cinéma français, il partage en 2005 avec Hélène De Fougerolles la tête d'affiche du Plus beau jour de ma vie, une comédie populaire sur le mariage. Mais c'est dans un registre plus noir que l'acteur-réalisateur, à qui l'on doit les courts Comme James Dean (2005) et Y'a pas de quoi , excelle. Agent immobilier escroc dans De battre mon coeur s'est arrêté (2005) de Jacques Audiard, il incarne le mari impuissant d'Isabelle Carré dans le thriller intimiste Entre ses mains, un chômeur pour le moins louche dans La Chambre des morts (2007) ainsi qu'un ami de longue date de Guillaume Depardieu dans Les Yeux bandés (2008).
En 2008, on le retrouve également, toujours aussi troublant, au générique d'Elève libre, drame de son compatriote Joachim Lafosse présenté à la Quinzaine des Réalisateurs à Cannes.
Avec son rôle dans Robin des Bois (2010) de Ridley Scott, l'acteur innove en jouant pour la première fois dans une grosse production américaine. De retour en France, il incarne le frère de François Cluzet dans le thriller Blanc comme neige avant d'interpréter l'amour d'enfance de Sophie Marceau dans la comédie L' Age de raison.
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