Accepté à l'université grâce à une bourse de football, William L. Petersen y découvre le théâtre pour lequel il se passionne. Il s'envole peu après vers l'Espagne pour apprendre le métier de comédien. De retour aux États-Unis, il monte sur les planches de nombreuses productions locales avant d'obtenir son premier rôle au cinéma en 1981 dans Le Solitaire sous la direction de Michael Mann, qu'il retrouve cinq ans plus tard dans Le Sixième Sens (1986). Entre temps, il partage l'affiche de Police féderale Los Angeles (1985) avec Willem Dafoe et débute à la télévision dans un épisode de La Cinquième dimension (1986).
William L. Petersen consacre en grande partie les années 90 aux long métrages, avec une succession de téléfilms et de seconds rôles sur grand écran, comme dans Young guns 2 (1990), Hard Promises (1991), Passed away (1992), ou encore Fear (1996). En 2000, il joue devant la caméra de Rob Cohen dans The Skulls, société secrète.
C'est le petit écran qui offre la consécration à William L. Petersen. En 1993, il participe à Return to Lonesome Dove, suite de la mini-série encensée par la critique quatre ans plus tôt. Mais c'est en 2001 qu'il explose grâce au rôle principal dans Les Experts, série la plus regardée aux États-Unis et en France pendant plusieurs saisons. Il incarne Gil Grissom, responsable de l'équipe de nuit de l'unité scientifique de la police de Las Vegas.
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